抗生素因为食品安全及细菌耐药性问题，其在饲料中的使用越来越受到限制。短中链脂肪酸（C1-C14）及其衍生物（脂肪酸盐及脂肪酸甘油酯）具有广泛的抑菌效果及其他营养作用，是抗生素强有力的替代品。脂肪酸及其衍生物在抑菌机理和抑菌效果受到碳原子数量和衍生产物类型的影响，并且其在饲料中的应用受到其它因素（饲料加工、胃肠道消化吸收、肠道内pH等）的影响。短链脂肪酸（以丁酸为代表）的抑菌作用、营养作用及其他功能性作用（如免疫、肠道屏障等）研究非常充分，但是其在饲料中的应用却受到了气味、加工、动物吸收等等方面的限制。随即出现了脂肪酸盐、包被脂肪酸及脂肪酸甘油酯。中链脂肪酸碳链长度在8到14之间，其抑菌机理与短链脂肪酸完全不同。中链脂肪酸甘油酯是一种非离子表面活性剂，可以直接穿过细菌细胞膜，并成为细胞膜的一部分，从而改变细胞膜的穿透性；同时抑制细菌中脂肪酶（在细菌定植黏膜细胞表面过程中所须的）的活性。中链脂肪酸及其衍生物抑菌效果高于短链和长链链脂肪酸，其低抑菌浓度比短链脂肪酸可低10倍。此外更有研究表明中链脂肪酸甘油酯对病毒有很强的抑制作用。本文综述了短中链脂肪酸及其衍生物的抑菌机理和抑菌效果，以期为养殖业应用此类产品提供使用依据。

　　文/图 上海亘泰实业集团 朱滔 黄小燕 王根虎

　　广东美瑞科海洋生物科技有限公司 虞予

 

　　近年来，脂肪酸及其衍生物的抑菌活性也一直受到人们的关注．已有研究表明，脂肪酸及其衍生物可抑制丝状真菌以及酵母菌的生长，同时也可抑制细菌的生长繁殖。研究表明脂肪酸及其衍生物对常见致病细菌（鼠伤寒沙门菌、单核增生李斯特菌、副溶血性弧菌）存在抑制作用。脂肪酸根据碳原子的多少分为短链脂肪酸、中链脂肪酸和长链脂肪酸。碳原子数为1-6的脂肪酸成为短链脂肪酸，也称挥发性脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸。碳原子数为8-14的脂肪酸成为中链脂肪酸，中链脂肪酸包括辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸。短链脂肪酸可以被肠道上皮细胞吸收，在肠道中既能作为能量被利用，也能调节肠道菌群平衡。并且短链脂肪酸对于维持大肠的正常功能和结肠上皮细胞的形态和功能具有重要作用。中链脂肪酸主要存在于椰子油和棕榈油等植物油中，己酸至癸酸含量在椰子油约为15％。棕榈油中的辛酸和月桂酸约占55-60％。另外反刍动物乳中含量也高，牛油中含量低于6％。大量研究表明，中链脂肪酸可以降低动物消化道和内脏微生物数量以及动物产品受微生物污染的机会。它不仅能够灭活病菌，还能改变病原体的致病毒性。实验表明，中链脂肪酸有减少梭状芽胞杆菌和沙门氏菌的毒力，抵抗疾病，减少肠道以及全身病毒的效果。因此本文综述了短链和中链脂肪酸及其衍生物的抑菌机理、抑菌活性，为其在动物日粮中的使用提供理论基础。

 

　　1、短链脂肪酸

 

　　1.1、抑菌机理

 

　　游离脂肪酸的一般抗菌活性机理。其中一种广为认可的假设是短中链脂肪酸以它们未解离的形式扩散到细菌细胞原生质内，然后解离，从而导致细胞内酸化(Sun等1998)。较低的细胞内pH可导致细胞内的酶失活(Viegas和Sa-Correia1991)，和氨基酸转运抑制(Freese等，1973)。

 

　　图1-1非电离有机酸抑菌杀菌机理

　　在偏酸（pH为3-4）的环境，非电离的有机酸可穿入大部分细菌胞膜，有机酸在胞内电离产生氢离子，而导致胞内pH偏低（Russell和Diez-Gonzalez，1998），影响到细菌内生物大分子的功能。为了维持胞内pH呈中性，细菌需动用能源ATP来运送氢离子到胞外。但此耗能工作终将导致细菌用尽能源而死亡（Guilloteau等，2010）。而酸根离子则有可能影响到胞核内的基因表达，下调其毒性，如侵入肠膜细胞能力。比利时科学家VanImmerseel等(2006)已证明丁酸对沙门氏菌就具有下调其毒性基因表达的效果，而导致沙门氏菌在肠道内的危害大为减弱。由于有机酸灭菌功能主要来自于非解离分子状态，而解离程度与环境pH值和其本身的解离常数（pKa），所以有机酸抑菌杀菌的效果受到环境酸碱度及其本身的电离特性（pKa）（表1）的影响。丁酸及丙酸的效率应高于甲酸、乳酸和苯甲酸。有机酸的杀菌作用在偏酸（pH=4）环境较偏碱（pH=7）环境强，在pH=4有机酸多以非电离结构存在，因而易于杀灭有害细菌。

 

　　表1，有机酸在家禽消化道的结构式与部位的酸碱度有直接关系

 

　　1.2、短链脂肪酸抑菌效果

 

　　表2列出丙酸及山梨酸在电离或非电离分子时对抑制几种有害细菌生长所需的最低浓度的比较。电离分子灭菌所需的浓度为非电离分子的11到350倍，因而失去了在饲料加工的实用性。由于有机酸须在偏酸的环境才有较好的灭菌功能，那么在猪的消化道只有胃的pH接近有机酸最佳的灭菌功能。对饲料到达胃之前的灭菌功能不大。据有机酸的消化试验报告（Bolton和Dewar,1965），大部分（95-99%）乙酸、丙酸及丁酸都在到达小肠之前被吸收入体内（表6），因而不能对小大肠提供显著功能。有机酸在胃中作为酸化剂的功能也会因为饲料配方中其他原料的中和能力而降低（表4）。即便是有机酸能过胃而到达小肠，其酸化或灭菌功能也会因肠道分泌大量的中和物（碳酸氢钙或碳酸氢钠）被大量削减。试验指出高剂量添加有机酸（1%）也不能显著降低盲肠的pH值（表5）。这也说明丁酸、丁酸钠/钙盐或包被丁酸即便是能过胃达到小肠，其功能效率也不显著。有机酸（如丁酸）应与另一分子结合因而其灭菌功能不受环境pH的限制（即在酸碱环境下，均能有效灭菌）。

 

　　表2，非电离或电离有机酸对抑制有害细菌生长的最低浓度

 

　　表3，不同有机酸在pH5.2抑制芽孢、大肠杆菌及乳酸菌的最低浓度比较

 

　　表4，常用饲料原料在酸性环境（如胃）的中和作用

 

　　表5，添加不同剂量的甲酸、丙酸或柠檬酸对41日龄肉鸡盲肠pH的影响

　　GauthierR.,2006.AustralianVeterinaryPoultryAssociationConference

 

　　Defoirdt等(2006)报道不同浓度的短链脂肪酸例如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸(1,10和100mM)在pH6时对坎氏弧菌的生长抑制的影响。他们进一步指出，在浓度为100mM时，所有的短链脂肪酸都显示出对坎氏弧菌生长100%抑制，然而在其他两个浓度时无效果。根据上述调查结果，Wolin(1969)报道在pH6,10mM的短链挥发性脂肪酸部分抑制大肠杆菌的生长。相似地，VanImmerseel等(2003)也报道，在同样的pH条件下，100mM的短链脂肪酸完全抑制肠炎沙门氏菌。

　　Defoirdt等(2006)报道短链脂肪酸(甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸)对坎氏弧菌的生长抑制作用具有pH依赖性。他们指出pH5，生长被完全抑制，然而在pH6时，生长抑制被推迟，在pH7无抑制效果。本研究结果与Wolin(1969)，McHan和Shotts(1993)和VanImmerseel等(2003)研究在不同pH条件下短链脂肪酸对大肠杆菌和肠炎沙门氏菌生长抑制效果的结果存在相关性。生长抑制效果依赖pH的原因实际上是因为在低pH时，占主导地位的未解离的脂肪酸能通过细胞膜(Sun等1998)。

 

　　1.3、短链脂肪酸在饲料中应用缺陷

 

　　a、短链脂肪酸发挥作用需要已未解离形式存在，需要在胃肠道中维持偏酸性环境，但肠道中ph偏中性（见表6）。

　　b、短链脂肪酸在胃肠道前段就已经作为能量物质被吸收，吸收率很高，很难达到肠道后段发挥作用。因此短链脂肪酸在胃肠道前段发挥作用，而包被脂肪酸可以控制其释放位点，从而在肠道后段发挥作用，而这也是有害微生物聚集的位置。

　　c、短链脂肪酸具有异味，添加至饲料中影响适口性

　　d、短链脂肪酸具有腐蚀性，添加至饲料过程中容易腐蚀加工设备

 

　　2、短链脂肪酸盐

 

　　短链脂肪酸具有很多的优点，因其具有游离性和挥发性的缺陷限制了其在饲料中的使用,饲料生产中将其制成相对稳定的钠盐,因此脂肪酸盐进入了畜牧业人员的眼中。

　　脂肪酸盐是一种常见的脂肪酸产品形式，但其恶臭气味给加工者带来麻烦，更重要的是此类产品把脂肪酸送达到肠道的能力十分有限，有学者报道脂肪酸盐形式的脂肪酸过胃后，超过99%的脂肪酸在小肠前端被快速吸收(Bolton和Dewar,1965)（如表6）。

　　1)、大约40%的脂肪酸盐在禽嗉囊被吸收；

　　2)、进入胃中，在盐酸的水解作用下，将脂肪酸盐分解为游离脂肪酸和氯化物；

　　3)、游离脂肪酸在小肠前段被吸收，无法到达肠道

 

　　表6，有机酸盐在家禽消化道浓度改变的测定

 

　　3、包被脂肪酸及脂肪酸盐

 

　　3.1、使用包被脂肪酸的原因

 

　　A、脂肪酸在小肠中很容易被吸收，通过包被可以使脂肪酸到达后肠道，发挥杀菌功能；

　　B、脂肪酸盐有特殊的脂臭味，是猪喜欢，人不喜欢，当使用者对脂肪酸盐气味不适应时采用包被产品；

　　C、防止产品受潮。

 

　　3.2、包被脂肪酸的材料

 

　　A、水溶性壁材包被：如糖浆、乳清粉、壳聚糖

　　B、脂溶性壁材包被：如棕榈油硬脂、羟化油脂等

 

　　3.3、抑菌效果

　　注：VanImmerseel等（2004）采用的是包被短链脂肪酸（甲酸0.22%、乙酸0.24%、丙酸0.27%用的film-coatedmicrobeads包膜微球，丁酸0.15%用的是spray-cooledmicrocapsules喷雾冷却微胶囊.），无菌小鸡仔5、6日龄攻毒肠炎沙门氏菌5×103cfu，第8日龄盲肠采样测定沙门氏菌含量。

 

　　3.4、缺陷

 

　　一些包被基质遇水被分解掉，即在进入动物体内或者刚到达消化道就已经被变为脂肪酸/脂肪酸盐；脂肪酸盐在胃中被水解，无法达到肠道，起不到抑菌的作用。

　　由硬脂酸和棕榈酸制成的胶囊，其消化率低（SminkW等，2008），仔猪没有足够的脂肪酶分解胶囊。脂肪酶仅在十二指肠发挥作用（小肠第一段）

　　氢化脂质制成的胶囊的消化率（如棕榈酸、硬脂酸和棕榈酸/硬脂酸甘油酯制成的胶囊）；熔点，50-60°C。

 

　　4、短链脂肪酸甘油酯

 

　　为了克服脂肪酸、脂肪酸盐及包被脂肪酸以上的难点，更好地应用脂肪酸，有专家将短链脂肪酸与甘油混合制备成短链脂肪酸甘油酯，生产应用较多的是丁酸甘油酯。其特点如下：

　　A、短链脂肪酸经过与甘油的共价结合，性质更稳定，不受高温和pH影响，而且没有原来的恶臭味道。

　　B、在肠道中被缓慢释放，发挥对肠黏膜的功能性作用；

　　C、具有更强大的杀菌作用

　　D、全程维护消化道

 

　　4.1、抑菌机理

 

　　A、通过水脂两亲特性破坏有害菌细胞膜

 

　　B、通过水通道蛋白进入细菌细胞

 

　　4.2、抑菌效果

 

　　短链脂肪酸及其甘油酯对一系列病原微生物都有抑制作用，包括包膜病毒、衣原体和细菌（Isaacs等，1995；Petschow等，1996；Bergsson等，1998；Bergsson等，1999）。

　　据报道，在肠道pH6-7时需要2.8%的纯丁酸(28kg/t)杀死54沙门氏菌菌株，如果我们考虑到微胶囊丁酸钠含24%的丁酸，则需要11.6%的包被丁酸钠在肠道中起到抗沙门氏菌的作用(116kg/t)，在pH7丁酸甘油酯的最小抑制沙门氏菌的浓度（同样抑制大肠杆菌O157)为0.06-0.12%。

 

　　据报道，脂肪酸甘油一酯的抑菌效果极强如：幽门螺杆菌、淋病奈瑟菌、链球菌和复杂疱疹病毒等，是游离脂肪酸的10倍以上。其抑菌活性不像游离脂肪酸一样依赖于pH,且极容易被微生物细胞吸收。

　　在体外培养基及不同pH（4.5/7）环境下，丁酸与丁酸甘油一酯对沙恩数据及梭状肠炎菌的杀灭功能比较。

 

　　5、中链脂肪酸及其衍生物

 

　　5.1、抑菌机理

 

　　尽管脂肪酸甘油酯的抑菌机理还不是非常清楚，但是其中一种比较合理的假设就是，脂肪酸甘油酯，作为一种非离子表面活性剂（Mroz等，2006），穿过细菌细胞膜，并成为细胞膜的一部分，从而改变细胞膜的穿透性（Kollanoor等，2007），同时抑制其中脂肪酶的活性，而脂肪酶对于其在黏膜细胞表面定植是主要的（Isaacs等，1995；Bergsson等，1998,2002）。电镜研究表明，脂肪酸甘油酯处理细菌时，细菌膜的浆膜溶解，而对细胞壁的肽聚糖无影响。（Bergsson等，1998）。脂肪酸及其甘油酯（如月桂酸甘油酯）在低剂量时会影响细菌信号传导、抑制毒性因子及耐药性基因的表达（Projan等，1994；Ruzin和Novick，1998）。除了这些作用外，中链脂肪酸甘油酯的还可以激活溶菌酶，也在一定程度上抑制细菌的生长（Tsuchido等，1985）。

 

　　5.2、抑菌活性

 

　　中链脂肪酸甘油酯抑菌活性较其他脂肪酸和衍生物具有更强的抑菌活性。Wang和Johnson（1992）报道，脂肪酸的抗菌作用随着链长度的增加而降低，中链脂肪酸的抗菌作用比长链脂肪酸更强。Isaacs等（1995）也指出含有8-12个碳的脂肪酸比长链脂肪酸的抗病毒和抗菌效果更好。中链脂肪酸与长链脂肪酸相比，疏水性较低且更易溶，其杀菌效果更好。中链脂肪酸对空肠弯曲菌的最小抑菌浓度（Hermans等，2010）比短链脂肪酸的最小抑菌浓度（VanDeum等，2008）低10倍以上。Boyen等（2008）年的研究结果类似，他发现中链脂肪酸（辛酸和癸酸）比短链脂肪酸（甲酸、乙酸、丙酸、丁酸）对54种鼠伤寒沙门氏菌的最小抑菌浓度低8倍，另外一些革兰氏阴性菌和阳性菌也有同样的情况（Nakai和Siebert，2003）。VanImmerseel等（2006）更是指出，在对沙门氏菌的抑制效果上，所有脂肪酸中，中链脂肪酸可能是最有效果的。此外，许多研究表明辛酸、癸酸和月桂酸的脂肪酸酯比其脂肪酸形式更能抑制细菌（Kabara等，1972；Bergsson等，1998,1999,2002；Petschow等，1998，Sprong等，1999）。

　　脂肪酸单甘酯，甘油二酯，甘油三酯的最小抑菌圈浓度（Kabara等，1972）

 

　　己酸、辛酸、葵酸对空肠弯曲菌的最低抑菌活性在ph6时分别为0.25、0.5、0.5mM，在ph7时分别为4、4、4mM（Hermans等，2010）。研究证明辛酸、辛酸甘油酯和辛酸盐对一系列细菌都有杀菌作用，包括大肠杆菌（Annamalai等，2004；Amalaradjou等，2006）、阪崎肠杆菌（Nair等，2004）和李斯特菌（Nair等，2005）。

 

　　Immanuel等（2011）研究了不同浓度辛酸和不同时间对副溶血性弧菌生长的影响。此研究表明在辛酸在100mM浓度时，5h就100%完全抑制病菌的生长。研究证明辛酸、辛酸甘油酯和辛酸盐对叉尾?爱德华菌、迟缓爱德华氏菌、链球菌和鲁氏耶尔森菌的最小杀菌量分别为10、5和100mm，10、5和100mm，15、5和75mm（Kollanoor等，2007）。

 

　　6、短中链脂肪酸甘油酯复合物

 

　　7、抑菌功能总结和比较

 

　　1.短链脂肪酸（乙，丙，丁）：丁酸具有多功能生理，及抑制细菌生长优势，但抑制范围及有效度，及环境应用限制因子（腐蚀性，恶臭，仅在酸性环境有效，水溶性太强极易在动物消化道内被吸收剂代谢）

　　2.丁酸钠，包被丁酸钠：有助消化道发育，但抑制细菌力弱，物化稳定性弱（电子键）

　　3.丁酸甘油酯（一酯）：抑制一般有害细菌力强，也有助消化道发育，其物化稳定性极强（共价键）

　　4.中链脂肪酸（C6，C8，C10，C12）：有抑制细菌生长功能

　　5.包被中链脂肪酸及甘油酯（一酯）：强化其抑制细菌功能，但是目前包被的工艺尚不成熟（包被过渡或包被不够）

　　6.短中链脂肪酸甘油酯（三酯，二酯，一酯）：扩大抑制有害病菌及病毒范围及有效度

 

　　脂肪酸功能总结比较如表所示

 

　　结论

 

　　抗生素问题是饲料和养殖行业现如今面临的最大挑战之一。虽然通过饲养管理措施的改进和添加一些饲料添加剂（氧化锌、益生菌）可以降低抗生素的使用，但是我们需要更加科学、准确、有效的措施来替代抗生素。短中链脂肪酸及其衍生物特制产品是动物机体正常代谢产物，残留和耐药风险很小。并且其在抑制革兰氏阳性菌和阴性菌时具有独特优势，脂肪酸单甘油酯在抑菌效果、抑菌机理、实际使用效果上都具有明显的独特优势。